Protective effects of tetramethylpyrazine on acute
　　Lu1ng injury and its mechanisms in rats
　　【ABSTRACT】Objective: To investigate the protective effect of tetramethylpyrazine(TMP) on lung tissues during ALI in rats and its possible mechanisms. Methods: All rats were randomly divided into four groups: Control group, OA group, tetramethylpyrazine treatment (TMP+OA) group and dexamethasone treatment(DEX+OA) group. Rat model of ALI was established by intravenous injection of oleic acid(OA). Malonaldehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) activity of lung tissues were detected in each group. Lung tissues were imbedded by paraffin to observe the expression of p38MAPK by means of immunohistochemistry staining. Results: Compared with Control group, 1MDA content increased obvious in OA group(P<0.05), but SOD activity decreased significantly(P<0.05), the expression of p38MAPK increased obvious(P<0.05); the administration of TMP and DEX mitigated above changes significantly(P<0.05). Conclusion: TMP is an effective antioxidant , which relieves the inflammation in acute lung injury rats , possibly through the inhibition of p38MAPK activation.
　　【KEY WORDS】tetramethylpyrazine; OA; acute lung injury; p38MAPK; antioxidation
　　
　　急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是由心源性以外的各种肺内外致病因素所致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。严重感染、创伤、休克等因素均可诱发，病情发展十分迅速，后期可并发多器官功能障碍，病死率高[1]，但其发病机制迄今为止尚未完全阐明。
　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛分布于细胞浆内，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的信号转导系统之一。研究[2]表明p38MAPK在急慢性炎症的细胞应激反应中具有重要性，与ALI关系密切。抑制p38MAPK途径，能够有效的抑制炎症反应，明显的减轻机体的炎症反应[3]。现代医学研究[4]表明，川芎嗪(TMP)具有降低氧自由基水平等多种药理作用，对心脑血管疾病具有防治效果，但其对急性肺损伤的预防和治疗作用方面的研究较少。因此，本实验采用SD大鼠静脉注射油酸（OA）的方法复制ALI动物实验模型，腹腔注射TMP进行预处理以观察其对肺组织的影响，并对其机制进行初步探讨，为临床上TMP抗ALI的使用提供一定的实验依据和理论基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物分组及急性肺损伤模型的制备
　　72只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重200-230g，由河北省实验动物中心提供，随机分为4组（1）Control组：由尾静脉注射生理盐水（NS），每只0.2 ml/kg；（2）OA组：由尾静脉注射油酸（OA），每只0.2 ml/kg；（3）TMP+OA组：OA注射前30 min腹腔注射川芎嗪（TMP）10 mg/kg；（4）DEX+OA组：OA注射前30 min腹腔注射地塞米松（DEX）10 mg/kg。分别于注射油酸后1 h、4 h和8 h处死取材，每个时间点6只动物。
　　1.2 检测指标和方法
　　1.2.1 光镜下观察肺组织形态学改变
　　取部分右肺下叶，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（5μm），HE染色，光镜下观察肺组织形态学改变。
　　1.2.2 肺组织匀浆上清液的制备
　　动物处死后，迅速摘取部分右肺下叶，用预冷的生理盐水洗去残血，滤纸吸干，分析天平称重后，于4℃条件下用电动匀浆器制成10%（W/V）的组织匀浆。取部分组织匀浆液以4℃ 4000rpm，离心10 min，吸取上清，分装后于-70℃储存；剩余的组织匀浆储存在-70℃冰箱中备用。
　　1.2.3 肺组织丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的测定
　　MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合形成红色产物，通过测定吸光度值（最大吸收峰为532nm）便可计算出样本中MDA的含量。按试剂盒说明书进行测定，单位为nmol/mg prot。
　　1.2.4 肺组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性的测定
　　通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，由于SOD是超氧阴离子的专一性抑制剂，故通过测定吸光度值（最大吸收峰550nm）便可计算出样本中SOD的活性。按照试剂盒说明书进行操作，单位为U/mg prot。
1.2.5 免疫组织化学染色观察肺组织中p38MAPK的表达
　　取部分右肺下叶组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，脱蜡水化。一抗采用兔抗p38MAPK多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），湿盒中37℃孵育90 min。SP免疫组化试剂盒、DAB均为武汉博士德生物工程有限公司产品。光镜下观察，以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性信号，阴性对照用PBS代替一抗。每组随机选取5张切片，每张切片随机选取5个不重叠的视野（×400），于NiKon光学显微镜下进行定性观察。应用形态学图像分析系统软件进行平均光密度（OD值）的测量，计算5个视野OD值的均值来代表该切片的平均OD值。
　　1.3 统计学处理
　　应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（ ±s）表示，单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间比较，以P<0.05为有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 光镜下观察肺组织形态学改变
　　Control组肺组织结构正常，肺泡壁薄，肺泡内无出血；OA组肺泡间隔增宽，大量炎细胞浸润，肺泡腔出血，肺泡壁断裂；应用TMP或DEX后肺水肿明显减轻，肺泡腔出血及炎细胞浸润减少（图1）。
　　2.2 肺组织丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的测定
　　与Control组相比，OA组肺组织中MDA含量明显升高（8h时最高, P<0.05）；应用TMP和DEX后肺组织MDA含量显著降低，但仍高于Control组（P<0.05，表1）。
　　Tab.1 Effect of different treatments on content of
　　MDA (nmol/mg protein) in the lung tissue of rats ( ±s, n=6)
　　Group MDA content
　　 1h 4h 8h (责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）