取上述DEPC水溶解的RNA 3山，目的基因的 下游引物2 pl(50 ns／Ixl)混匀，于70℃变性5 min， 迅速冷至4℃5 min，加入5×逆转录缓冲液4山， MgCl，4．8¨l(25 mmoL／L)，10 mmoL／L dNTPs 1 p,1，40 u／山RNA酶抑制剂0．5一，22 u／斗l逆转录酶
AMV 1山，加灭菌双蒸水至20斗l，于25℃5 min，42℃60 rain，70℃15 min，获得cDNA，一20℃保存 备用。
取上述cDNA 3 p,1为模板，加入10×Pfu高保真酶缓冲液5一，10 mmol／L dNTPs 1山，Pfu高保 真酶1 p,l、GoTag DNA聚合酶0．5 Izl，目的基因上、 下游引物各2 p,1(50 rig／山)，加灭菌双蒸水至50 斗l，充分混匀。反应条件为95。C 3 min；三步循环
940C 1 min、55℃l min、720C 2 min，共30个循环；72℃延伸10 rain。取PCR产物上样电泳，观察OPG 和FGF-2的转录结果，并用细胞总RNA样品为模板 进行PCR作为阴性对照。
1．7 Western blot分析两种目的蛋白的表达接 种复制缺陷型重组腺病毒FGAd／OPG—I—FGF2于 细胞丰度达到90％一95％的Vero细胞，3—4 d后， 收获感染的细胞于10 IIll离心管中，3 000 r／min离 心5 min。加3 ml 4℃预冷的PBS洗3次，细胞沉淀 按1 ml细胞裂解液加10仙l PMSF(100 mmoL／L)混 匀，冰上裂解30 min，期间为使细胞充分裂解经常摇动，于4℃12 000 r／min离心30 min，取上清加蛋白上样缓冲液煮沸5 min，取10 ml行SDS—PAGE电泳、转膜、封闭，加入一抗孵育2 h，用TBST洗涤3 次，每次10 rain；HRP标记二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，再用TBS洗10 min；在暗室中按0．125 ml／cm2的用量标准及膜的大小，等体积混合 用于ECL检测的鲁米诺试剂和氧化剂，可见到膜上 出现绿色荧光条带。对x光片曝光适当时间，经显 影、定影处理后晾干保存。同时以正常培养的Vero 细胞裂解液作为阴性对照。
2结果
2．1 ⅣS-IRES基因片段的体外扩增和鉴定 以 pIRES质粒为模板，用含有Bgl II和Sal I酶切位点 的1对引物进行PCR扩增，获得约900 bp的IVS— IRES，克隆至pGEM-T载体，获得pGEM—T／IVS- IRES。经BglII和Sal I双酶切后，凝胶电泳显示得 到约900 bp和3 000 bp的DNA片段，表明克隆载体 构建成功，见图1。送上海生工生物工程技术有限
公司进行IVS—IRES序列测定未见突变。
2．2穿梭质粒pSC／OPG-l•FGF2的酶切鉴定结 果重组质粒用Nhe I和Sal I双酶切，预期结果 为2 700 bp和7 400 bp两条带。l％的琼脂糖凝胶 电泳显示符合预计酶切结果，见图2。
2．3重组腺病毒质粒pFGAd／OPG-卜FGF2的酶 切鉴定结果 穿梭质粒pSC／OPG—I—FGF2的右臂 (rig}lt arnl)与腺病毒骨架载体pAdEasy一1的右臂 (fight arm)同时共有Ads病毒基因组3 534—5 790 bp的序列，可有效介导二者同源重组；穿梭载体的
左臂(1eft arln)与骨架载体的左臂同时共有腺病毒
AdS的右侧末端34931—35 935 bp的序列，同源重
组可在此区发生，或在其共有的质粒复制原点Ori 处发生。两种不同的重组方式会影响到限制性内切 酶EcoR I位点数量的变化，Bam HI和Pac I酶切结 果也各自不同。我们的结果显示EcoR I酶切与 Bam H I酶切均与预计相符，Pac I酶切为4 500 bp 的片段和约33 000—34 000 bp的大片段，表明同源 重组发生在两者的Ori与右臂同源序列之间。获得 腺病毒质粒，命名为pFGAd／OPG—I—FGF2，Pac I酶切 电泳
图2 pSC／OP6•卜FGF2的酶切鉴定
l：DL 15 000 Marker；2：Nhe l和Sal l双酶切pSC／OPg一卜
图3重组腺病毒质粒pFGAd／OPG-I-FGF2的酶切鉴定
l：DL 15 000 Marker；2：Pac I酶切
2．4 重组腺病毒FGAd／OPG-I-FGF2的获得 Pac I酶切pFGAd／OPG．I．FGF2，纯化回收，获得重组 腺病毒基因组的DNA分子，转染293细胞。大约7
～10 d，将转染的细胞一80℃速冻、37℃速融，反复3 次后取l ml的裂解产物接种至已形成单层、含2％ FCS DMEM维持液的293细胞中，于370C，5％C02培养箱中培养并逐日观察细胞病变。重复上述操
作，直至293细胞出现肿胀，圆缩等典型的细胞病变 效应(CPE)，得到复制缺陷型重组腺病毒FGAd／ OPG—I—FGF2，见图4。
图4 293细胞感染FGAd／OPG•I—FGF2出现CPE X 100
A：正常293细胞；B：出现CPE的293细胞
2．5 RT•PCR分析FGAd／oPG-I-FG砣两种基因 的转录 由于本实验所用的OPG基因是从人肾上 皮细胞系293细胞逆转录得到的"J，因此我们采用 了来源于非洲绿猴肾传代的Vero细胞进行基因转 录及蛋白表达的分析。将FGAd／OPG．I—FGF2接种 Vero细胞，常规方法提取细胞总RNA，逆转录获取 eDNA。以cDNA为模板，同时加入OPG和FGF2两 对特异性上下游引物行PCR，分析两种基因的转录 情况，并以总RNA为模板作为阴性对照。PCR产物 琼脂糖电泳，显示同时得到约1 300、500 bp的两条 片段，以总RNA为模板的PCR结果无相应条带，说 明两种基因可有效转录，见图5。
图5 RT-PeR分析FGAd／OPG•I-FGF2 感染Vero细胞中两种基因的转录
1：总RNA模板阴性对照；2：DL2 000 Marker；3：重组病毒感染 Veto细胞的RT-PCR产物
2．6 FGAd／OPG-I-FGF2感染Vero细胞表达目 的蛋白的western blot分析取2．5中FGAd／OPG— I-FGF2感染Veto细胞的裂解液经SDS．PAGE蛋白
电泳、转膜、分别加抗人OPG和抗人FGF-2的一抗
孵育，TBST洗后再加相应的二抗，曝光，发现分子量 分别为约63 ku的OPG和约18 ku的FGF-2特异性 蛋白条带，正常Vero细胞对照组为阴性，见图6。
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