基因治疗是建立在现代生命科学理论和技术之 上的一项极具前景的全新的疾病治疗手段，在肿瘤、 遗传、代谢和病毒性疾病上取得了令人可喜的成果。 在基因治疗的众多载体中，腺病毒(adenovirus，Ad)
载体以其高效转染和高效表达的特点成为目前基因 治疗常用的载体之一⋯，在已使用的所有病毒及非 病毒载体中，Ad载体名列第一，约占24％。牙周病 特征性表现为附着丧失、牙槽骨吸收。目前，临床上 尚无有效的治疗方法。在治疗牙周病时可以通过手 术去除致病因素，再利用基因治疗技术表达细胞因 子以促进组织的修复和再生，研究发现同时转移并表达多个外源基因较单个基因在基因治疗领域的应用价值更高。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)具有 抑制破骨细胞功能，碱性成纤维生长因子(basic fi． broblast growth factor，bFGF-或FGF2)能促进组织细 胞增殖，从而阻断破骨细胞的分化、成熟与激活，同 时促进牙周细胞增殖，创造出一个利于牙周组织缺 损修复的环境，达到修复牙槽骨缺损、形成新附着的 目的。本研究利用脑炎心肌炎病毒内部核糖体结合 位点(intemal ribosome entry site，IRES)可同时实现 基因共表达的特点，构建可同时表达OPG和FGF2 两种基因的双顺反子复制缺陷型重组腺病毒 FGAd／OPG-I-FGF2，并进行鉴定分析，为联合应用基 因工程与组织工程技术治疗牙周病研究打下基础。
1材料与方法
1．1材料和试剂
1．1．1 质粒，菌株与细胞 穿梭载体pShuttle． CMV，腺病毒骨架载体pAdEasy—l由Johns Hopkins 大学BVogestein教授惠赠，plRES载体为美国BD Bioscience Clonteeh公司产品，含腺病毒骨架载体 pAdEasy—l的E．coli BJ5 1 83／p菌株、E coli DH5 ot、E． coli DH 10B，非复制型Ad包装细胞系293细胞，Ve- ro细胞均为本室保存，重组质粒plRES／OPG．FGF2 的构建见文献旧J。
1．1．2 工具酶及其他生化试剂 限制性内切酶 Pac I购自美国New England Biolabs；其它限制性内 切酶及T4 DNA连接酶为MBI公司产品；pGEM．T Easy载体、GoTaq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶购自Promega公司；Trizol、逆转录试剂盒、脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品； ECL检测的鲁米诺试剂和氧化剂购自Pierce公司； 硝酸纤维素膜购自Amersham公司。兔抗OPG (BAl475)抗体为武汉博士德生物工程有限公司产 品；兔抗FGF-2(SC-79)为Santa Cruz产品中杉分 装；HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz生物公 司。其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．2 IRES基因片段的体外扩增和鉴定
1．2．1 引物的设计根据IVS•IRES核苷酸序列设计并合成一对引物IVS—IRES—Beg：TAG AGA TCT
ACT GGG CAG GTA AGT ATC AA，IVS—IRES—End： TAG GTC GAC CCT CAC TAA AGG GAA GCG；两条 引物的5’端分别引入限制性内切酶Bgl II和Sal I 酶切位点。引物由上海生工生物工程技术有限公司 合成。
1．2．2 以质粒pIRES为模板扩增IVS—IRES基因片 段取10 rig／山的pIRES 1山为模板，加入10 pmoL／L上、下游引物各1一，10 mmol／L dNTPs 1山， Pfu高保真酶1山、GoTag DNA聚合酶0．5一，10× Pfu高保真酶缓冲液5斗l，补加灭菌双蒸水至50斗l， 充分混匀。反应条件为95℃3 min；然后94℃1 min、550C 1 min、72℃1 min，30个循环；72℃延伸15mino
1．2．3 目的基因克隆和序列测定PCR产物用 DNA纯化回收试剂盒回收，与pGEM-T载体进行连 接反应，按常规转化E coli DI-ISa感受态，并提取质 粒DNA，经酶切鉴定选取阳性克隆送上海生工生物 工程技术有限公司进行序列测定，获得pGEM—T／IVS—IRES重组质粒。
1．3构建含oPG和FGF2两种基因的双顺反子腺 病毒pShuttle-CMV穿梭质粒
1．3．1含间插序列(intervening sequence，ivs)及两 个多克隆位点的穿梭载体pSC／IVS-IRES的构建 用Sgi 1I和Sal I酶切pGEM-T／IVS-IRES重组质粒 与穿梭载体pShuttle—CMV。IVS—IRES经回收后与线 性化的pShuttle—CMV相连，转化E coli DHl0B，摇 菌提质粒，用BdⅡ和Sal I双酶切鉴定。
1．3．2构建含OPG和FGF2的穿梭质粒用Nhe I和Sal 1分别双酶切双顺反子共表达质粒plRES／ OPG—FGF2和pSC／IVS—IRES，琼脂糖凝胶回收OPG- IRES．FGF2片段，无水乙醇沉淀回收线性化的pSC／ IVS．IRES，干燥，适量ddH20溶解。用T4 DNA连接 酶将上述2个片段16℃水浴连接过夜。取适量连 接产物转化E．coli DHIOB感受态细菌，涂含有Kana 的LB平板，37cc培养过夜，挑取单个菌落，接种于 含Kana的LB培养液内，37℃培养过夜。以碱裂解 法小量制备质粒，用Nhe I和Sal I双酶切鉴定，得 到插入有OPG-IRES—FGF2的双顺反子穿梭质粒，命 名为pSC／OPG—I—FGF2。
1．4重组Ad质粒的构建限制性内切酶Pme I 线性化Ad穿梭质粒pSC／OPG-I-FGF2，琼脂糖凝胶 回收，转化至氯化钙法制备的含Ad骨架载体
pAdEasy一1的E coli BJ5183／p感受态细菌，Kana抗性选择阳性单菌落，用Pac I、EcoR I和BamH 1
分别单酶切筛选重组Ad DNA质粒并鉴定重组位 置；将所得到的重组质粒转化E．coli DHl0B，获得高 拷贝的重组Ad质粒pFGAd／OPG一卜FGF2。
1．5双顺反子复制缺陷型重组Ad的获得Pac I 酶切重组Ad质粒pFGAd／OPG-卜FGF2，完全消化 以去除Ori和Kana抗性基因等质粒构件，并暴露其 反转重复序列(ITR)，用无水乙醇回收纯化。在T一25培养瓶中培养293细胞，待细胞丰度约90％时，将上述Pac I消化获得的重组Ad DNA用Lipo— fectamine 2 000转染，获得双顺反子复制缺陷型重组 Ad FGA(L／OPG•I—FGF2。
1．6 RT-PCR分析FGAd／OPG-I-FG砣目的基 因的转录 接种复制缺陷型重组腺病毒FGAd／ OPG—I-FG砣于细胞丰度达到90％一95％的Vero 细胞，3—4 d后，用Trizol试剂常规提取感染细胞的 总RNA，溶于1％o焦碳酸乙二酯(diethyl pymcarbon• ate，DEPC)处理过的无RNA酶的水中，可保存于一80℃冰箱。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
