硫酸铵是蛋白质粗分离中广泛使用的盐类， 它使蛋白质与水溶性的多糖等杂质分离开¨引，还 能保护蛋白质的活性．两性电解质在其等电点时 在溶液中的溶解度最小，因此本实验选择硫酸铵
和等电点沉淀目的蛋白质，由图2可以看出硫酸
铵为70％饱和度时沉淀率达到最高值，为
96．O％，由图3可以看出，pH为4时，蛋白质的沉 淀率达到了最大值57．1％．将两者最适条件结合 起来，验证蛋白质沉淀率是否达到最高值，测得沉 淀率达到96．7％，故选用二者结合起来的方法。 沉淀蛋白质，收集沉淀待下一步透析．
2．3 Sepharose CL一6B柱分离总蛋白质
．，凝胶过滤色谱是目前最广泛使用的蛋白质分 离方法之一，它是所有色谱技术中最简单、条件最 温和的方法，且完全是基于样品的相对分子质量 大小来进行分离的．本实验采用Amersham公司 的Sepharose CL一6B作凝胶的载体．Sepharose
cL“B是应用交联剂制备得到的琼脂糖，它有
比较好的稳定性，能用于浓脲、胍、有机溶剂及非离子型去污剂溶液；还能经受110—120℃高压灭
菌处理，其机械强度要大于葡聚糖凝胶和聚丙烯 酰胺凝胶；对蛋白质等高分子的吸附作用也小的 多，适用相对分子质量的范围宽．
硫酸铵浓度批
图2硫酸铵浓度对沉淀效果的影响
60
势．由此初步推测洗脱得到的两个峰，记为Fr—
l、Fr一2，它们可能有糖蛋白．收集洗脱峰，进行透 析，浓缩，然后冷冻干燥得到样品．考玛斯亮蓝法 测蛋白质的含量，苯酚硫酸法测得糖的含量，得出 Fr一1中糖与蛋白质含量比1．156，Fr一2为
1．209．
2．4 Fr一1、Fr一2的红外分析
对于红外光谱，每种氨基酸残基都是发色团， 它适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白 质和多肽的测定．
4000 3750 1500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750．500
I止m
图6 Fr一2的红外光谱图
Fr一1的红外光谱表明，该物质有蛋白质和 多糖的特征吸收峰．由图5可以看出，在3 500—
3 200 em“之间的宽峰是0一H和N—H的伸缩
图4 总蛋白质Sepharose CL一6B的洗脱曲线
图4是猕猴桃中总蛋白质经过Sepharose CL一6B柱层析的洗脱曲线，由图4可以看出样品 被分为两个峰．从各管的收集液中，测定糖含量并 结合总蛋白的220 nm的吸收峰，结果发现在7—
10、16～20管的层析洗脱液中，蛋白质含量高低
与其对应的收集液中糖含量的高低呈现一致的趋
振动，说明存在分子间和分子内的氢键．3 000—
2 800 em“的峰是糖类C—H伸缩振动，在l 640
em“附近出现的特征吸收峰为糖的水化物的特
征吸收峰¨“，1 400～1 200 em“间的一组峰是C
—H的变角振动．其中1 120—1 105 em一是羟基 的特征吸收峰，1 147—960 em“之间的一组强峰 是毗喃糖环的醚键和羟基的吸收峰，842．89 em。
的吸收峰为毗喃糖d型的c—H平伏键，表明该
物质为糖蛋白且含有d型糖苷键． 图6为Fr一2的红外光谱图，从图6可知，在
3 423 cm‘1附近出现的特征吸收峰为羟基的O—H 伸缩振动¨2‘，它是多糖分子的特种吸收峰；2 889 为糖的C—H伸缩振动．在1 650 cm“附近出现的 特征吸收峰为蛋白肽链羰基的吸收峰¨引；在l 127 一l 025 cm一处出现的特征吸收峰为C—O键吸收 峰¨41。由此可推知其糖苷类型主要为吡哺型．因 此，由以上分析结果可知Fr一2为一种糖蛋白．
2．5 Fr—l、Fr一2糖肽键性质的分析
糖蛋白或糖肽的p一消除反应，能够把与肽 链上丝氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水 解下来，而与天冬氨酰相连的N一型糖链则不能 被稀碱水解．因此通过测定碱处理前后紫外吸收 光谱的变化，来确定糖肽键的类型．
吸收波长／nm
图8 Fr一2的图谱
由图7、图8可以看出样品经过碱处理后在
240 nm有一个明显的突跃，形成O一糖肽键的丝 氨酸或苏氨酸经过碱处理后形成0c一氨基丙烯酸 和a一氨基丁烯酸，而这2种氨基酸在240 am均
存在特征吸收，所以说明这两个组分中糖和蛋白
均是通过O一糖肽键连接的⋯1
3 讨论
研究了从猕猴桃果汁中提取总蛋白质，充分 考虑各种因素对总蛋白提取的影响，最终选择了 最佳提取条件，20％的乙醇作为提取剂，l：6的料
液比。25℃提取40 rain，每100 mL中提取55．05
mg，将总蛋白质提取液用70％硫酸铵结合pH4．0 等电点沉淀法，沉淀率达到96．7％，试验过程中 硫酸铵的加入按多次少量的原则，有较好的沉淀 效果．沉淀样经透析除盐，PEG6000浓缩，干燥得 到的样品经Sepharose CL一6B柱层析，得到Fr一
1和Fr一2两个洗脱峰，220 nm紫外检测和苯酚 硫酸法跟踪检测，初步判断Fr—l和Fr一2均为 糖蛋白，分别测得蛋白质和糖含量比，Fr—l为
1．156。Fr一2为1．209．红外光谱分析，确定Fr一1 和Fr一2均为糖蛋白，通过B一消去反应证明了 两种糖蛋白均存在O一糖苷键．
猕猴桃具有多种药理作用，可帮助消痔肿、止 呕吐，延缓头发变白、治疗胃炎、肠炎等病症，但是 目前，对猕猴桃糖蛋白的研究这一方面还是一个 空缺，有关猕猴桃糖蛋白的活性作用以及在医学 方面的应用有待进一步研究．为下一步猕猴桃糖 蛋白的研究奠定基础．
参考文献：
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[3] 臧大存，王璋，陈舜祖．中华猕猴桃蛋白酶 性质的研究及其在肉类内化剂制备中的应 用[J]．无锡轻工业学院学报，1986，5(4)：(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
