2 结果 2.1 分离纯化结果 皮肤分泌物的粗提物经过凝胶过滤层析纯化后，以280nm为监测波长，收集各峰，并以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌，药敏片法检测抑菌活性峰，确定其中4号峰为活性峰。利用制备型反向
2 结果
2.1 分离纯化结果
皮肤分泌物的粗提物经过凝胶过滤层析纯化后，以280nm为监测波长，收集各峰，并以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌，药敏片法检测抑菌活性峰，确定其中4号峰为活性峰。利用制备型反向高效液相色谱，C18反相色谱柱继续对凝胶过滤层析活性峰作进一步的分离，以215nm作为监测波长，收集各峰，同样以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌测定各收集峰的抑菌活性，最终获得中华大蟾蜍抗菌肽。图1为粗提物凝胶过滤层析及高效液相色谱分离图；图2为凝胶过滤层析（左）、高效液相色谱（右）活性峰的抑菌结果。
2.2 对SW480杀伤作用
将中华大蟾蜍抗菌肽作用于大肠癌细胞SW480，倒置显微镜下观察，对照组的细胞结构完整，而在抗菌肽组中，当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化，细胞变小、变圆，折光率变大，细胞整体明显皱缩，边缘不光滑，细胞间隙明显增大，漂浮的死细胞增多，且伴有细胞碎片的悬浮。当抗菌肽浓度达到0.3mg/mL、0.5mg/mL时，看不到细胞存在（图3）。
2.3 MTT实验结果
不同浓度抗菌肽组作用于大肠癌细胞48小时后，其抑制率曲线如图4所示。中华大蟾蜍抗菌肽对大肠癌细胞SW480细胞有生长抑制作用呈现量-效关系。当中国大蟾蜍抗菌肽的浓度达到60μg/mL大肠癌细胞SW480细胞开始有抑制作用，当浓度达到200μg/mL时抑制率幅度增长缓慢，在浓度（10～40）μg/mL时并没有变现出抑制作用。
3 讨论
两栖动物抗菌肽的抗癌作用机理比较复杂[11]，目前主要以细胞骨架损伤学说为主，认为抗菌肽对正常的哺乳动物细胞和肿瘤细胞均具有损伤作用，但由于哺乳动物细胞骨架完整，且修复快，故抗菌肽对其不造成最终损伤，而肿瘤细胞骨架不完整，当被抗菌肽作用以后，得不到及时有效的修复而导致最终损伤。还有研究者认为抗菌肽可以从细胞膜、线粒体、核膜、细胞核染色体DNA、溶酶体等几个方面影响癌细胞的生存[12]，且能调动机体免疫系统，抵抗癌瘤的侵袭，这主要是从体液方面来实现。Jaynes等报道以CecropinB为蓝本，合成一种新型的抗菌肽，不仅对细菌、真菌和原虫有较强的穿透作用，而且对肿瘤细胞有明显的杀伤作用；Chen JY等[13]还证实抗菌肽Epinecidin-1抑制人白血病细胞的增殖，诱导细胞凋亡；赵瑞君等[14]报道家蝇成虫抗菌肽对肿瘤细胞109、K562、Daudi及T24的有效杀伤力都在85%以上，
本实验通过对中华大蟾蜍乙醚刺激获得皮肤分泌物，利用分离凝胶过滤层析和反向高校液相色谱层析两种分离纯化方法，获得中华大蟾蜍抗菌肽。实验结果显示，中华大抗菌肽除了具有抗菌效果，而且对大肠癌细胞SW480同样具有很好的抑制作用。我们利用细胞形态学的方法，在倒置显微镜观察到细胞的一些变化，当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化，细胞贴壁性下降，细胞变小，边缘不光滑，细胞间隙明显增大，当抗菌肽浓度达增大到0.3mg/mL和0.5mg/mL时，只能观察到细胞碎片的存在。我们还利用MTT法研究中华大蟾蜍抗菌肽对大肠癌细胞SW480生长抑制作用，结果显示，抗菌肽浓度在（60～200）μg/mL时，中华大蟾蜍抗菌肽对SW480细胞抑制率成量-效关系，而当抗菌肽达到200μg/μL以上的浓度时，对癌细胞的抑制率增长比较缓慢。
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