Growth Inhibiting Effect of Antibacterial Peptides in Bufo Gargarizans on Cancer Cells
CHEN Liping HE Lili BA Yunfei
Department of Neurology，the People's Hospital of Dehui City in Jilin Province，Dehui 130300，China
[Abstract] Objective To screen the Bufo bufo gargarizans cantor active materials，and test its antitumor activity. Methods The Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was separated and purified by gel filtration chromatography and HPLC. The colorectal cancer SW480 was used as the model in vitro. The cell morphology and MTT were accepted to study the lethal effect and growth inhibiting of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides to SW480. Results It indicated that a species of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was got through gel filtration chromatography and HPLC. The number of cells reduced，and the shap of the cells become shrinkage round significantly treated by Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides. The more Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides added，the more lethal effect and growth inhibiting effection was showed up by MTT. Conclusion The experiment is successful in screening Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides，and testing the role of inhibition of growth to SW480 in vitro.
[Key words] Bufo bufo gargarizans cantor；Antimicrobial peptide；Growth inhibiting
抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽是一种小肽，分子量一般小于10kDa，仅仅包含12～50个氨基酸，由基因编码、核糖体合成[1-3]。抗菌肽一般可以形成α-螺旋和β-折叠，抗菌肽的α-螺旋结构具有完美的水脂两亲性[4]，此结构是决定抗菌肽抗菌活性的基础。它除有非特异性的抗细菌、真菌、病毒等病原体外，还有抗肿瘤细胞的作用，特别是对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，而不破坏人体的正常细胞，是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药，是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。1980年，Boman等科学家在惜古比天蚕蛹的体内纯化到一种被称为cecropin[5]的昆虫抗菌肽，1987年，从光滑爪蟾的皮肤中分离纯化得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今为止，研究者已从两栖类动物皮肤中筛选到1000余种抗菌肽[6]，而以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。
本实验通过对中华大蟾蜍进行乙醚刺激，生理盐水收集其皮肤分泌物，利用凝胶过滤层析及反向高效液相色谱两种方法，分离纯化皮肤分泌物中的抗细菌、抗肿瘤活性物质，并对其抗细菌、抗肿瘤活性进行初步活性检测，以期筛选出新的抗细菌、抗肿瘤药物，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物、细胞及菌种 中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans cantor）两栖纲（Aves）、无尾目、蟾蜍科、蟾蜍属族，本试验材料购自市场。大肠埃希氏杆菌E.coli ATCC25922、金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923均由本实验室保存；大肠癌细胞SW480由吉林大学中日联谊医院馈赠。
1.1.2 实验仪器 凝胶过滤柱（长100cm，直径25mm）、高速离心机（Eppendorf）、真空冷冻干燥机（FD-1-50）、KTA explorer100（GE）、制备型反相高效液相色谱LC-8A（岛津）、C18半制备柱（ACE）、超纯水机（ROP-100）和自动板式酶标仪ZS-2。
1.1.3 实验试剂 SephadexG-25填料购自GE公司；Na2HPO4-
NaH2PO4，pH6.0；三氟乙酸（Sigma，HPLC级）；乙腈（Merck，HPLC级）；超纯水（含0.1％TFA）；乙腈（含0.1％TFA）；MTT，DMSO均购自Sigma公司；MEM培养基、MH固体培养基均购自于TaKaRa公司。
1.2 实验方法
1.2.1 中华大蟾蜍皮肤分泌物的收集 活体中华大蟾蜍30只，用超纯水充分冲洗皮肤，放入密闭容器中，乙醚刺激2～3min，中华大蟾蜍皮肤表面可见泡沫状物质从皮肤分泌出来，立刻用生理盐水冲洗，收集冲洗液，12000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥后，放入-40℃低温保存。
1.2.2 凝胶过滤层析半纯化抗菌肽 将SephadexG25柱装好后，用超纯水以1.0mL/min的流速冲洗2～3倍柱体积。再用流动相（Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0）以3.0mL/min的流速平衡2～3倍柱体积。在215nm、280nm波长下监测，上样及洗脱在SephalexG25色谱柱平衡后，加样品溶液1～2mL，用流动相溶液以3.0mL/min的流速进行洗脱，将每个峰分别收集，以S.aureusATCC25923作为实验样品检测的指示菌，药敏片法检测各收集峰的抑菌效果。
1.2.3 制备型反相高效液相色谱纯化抗菌肽 样品经凝聚过滤层析后，收集具有抗菌活性的物质并将其真空冷冻干燥，然后溶于含0.1%三氟乙酸水溶液中，然后用10000转离心5min，吸取上清液弃沉淀，接着把上清液过0.22μm的滤膜。A液为含0.1％三氟乙酸的超纯水，B液为含0.1％三氟乙酸的乙腈。流速设置为2mL/min，每次上样2mL，根据色谱曲线中的色谱峰，分步收集各峰的样品，并记录时间，以S.aureus ATCC25923作为实验样品检测指示菌，检测各峰的抑菌活性，将具有抗菌活性物质即中国大蟾蜍抗菌肽真空冷冻浓缩。
1.2.4 癌细胞杀伤作用 将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中，浓度为5×105cell/孔，终体积为100μL，过夜培养12h。我们将抗菌肽样品经过0.45μm滤器过滤，并将其浓度稀释为0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL，作用于SW480细胞（抗菌肽组），24h显微镜观察结果，与空白对照组对比癌细胞变化情况。
1.2.5 对SW480细胞的生长抑制作用 多肽对肿瘤细胞增殖的抑制作用是用MTT-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）2，5-diphenyl tetrazolium romide测定的[7-10]。我们将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中，浓度为5×103cell/孔，终体积为100μL，贴壁培养24h，培养条件温度37℃，5%的CO2，湿度95%。把中华大蟾蜍抗菌肽用PBS充分溶解，不同浓度的多肽与肿瘤细胞共培养24h（多肽在96孔板中最终浓度为0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL），并且每个浓度要有三个平行孔。吸掉培养液，然后加入100μL的DMEM培养基和20μL的MTT（浓度为5mg/mL）继续培养4h。然后吸掉上层培养液后加入150μL的DMSO后，震荡10min后，用酶标仪在570nm下测量其吸光度值。 (责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
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中华大蟾蜍抗菌肽对癌细胞的生长抑制作用
来源：网络(转载) 作者：陈丽萍 何丽莉 巴云飞 发表于：2012-02-08 21:02 点击：次
【关健词】中华大蟾蜍；抗菌肽；生长抑制
目的 筛选中华大蟾蜍抗肿瘤活性物质，检测其抗肿瘤活性。方法 本实验通过凝胶过滤层析及高效液相色谱法，从皮肤分泌物中分离出具有抗细菌、抗肿瘤活性的物质，即中华大蟾蜍抗菌肽。以大肠癌细胞为体外实验模型，通过细胞形态学、MTT实验，研究中华大蟾蜍抗菌肽对SW480细
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