BDC2.5 T细胞是一个NOD小鼠来源的胰岛反应性CD4+T细胞克隆，在1型糖尿病的发病和转移性糖尿病实验中起重要的作用〔5〕。IL17是源于CD4细胞分化而来的TH17细胞分泌的细胞因子，是重要的局部组织炎症反应的促炎性因子〔1〕，已有的研究表明IL17与1型糖尿病的早期发病有着密切的关系〔6〕。因此，改造CD4+细胞来源的BDC2.5 T细胞，提高/抑制其IL17的表达，可为研究IL17在CD4介导的1型糖尿病发病中的作用提供重要的实验模型。
逆转录病毒载体能够整合入宿主细胞的染色体，稳定介导外来基因的表达，是目前最常用的基因转移工具之一。据研究，载体中的启动子/增强子系统能在一定程度上提高目的基因的表达水平，而U6增强子可高效驱动以逆转录病毒为载体的siRNA基因在多种细胞中表达，为转基因实验广泛采用〔7〕。另外，在IL17 cDNA两端分别设计了与病毒载体相匹配的Bgl Ⅱ和Sal I 黏性末端，有利于酶切后与载体的匹配连接；同样，在双链的siRNAIL17的5′端和3′端也设计了酶切位点Hpa I和Xho I，有利于siRNAIL17和U6的连接，在U6的5′端还设计了Xba I，有利于U6和siRNA插入到病毒载体中。再者，通过流式细胞学技术可定量测定包装细胞的病毒转导率，为获得高滴度的逆转录病毒提供了有利的支持(经NIH3T3细胞鉴定，实验所需病毒滴度在5×106～107 CFU/ml之间)。实验结果，siRNAIL17组的IL17表达较IL17组显著降低，几乎呈现不表达状态，说明了IL17的特异性小片段siRNA在宿主细胞内表达能够强有力地抑制其目的基因的表达，使宿主细胞保持了IL17低水平的表达或不表达。
本研究利用T细胞活化、恒温孵育和聚凝胺的正电荷对细胞膜的吸附作用，可把逆转录病毒对原代细胞的转染率提高至15%～20%，使经常的实验细胞转染率也保持在5%左右。同时，采用第一信号途径和共刺激信号途径活化T细胞，更易于逆转录病毒的转染。总之，本实验系统的优势在于：①提高了逆转录病毒对T淋巴细胞转染的效率，②允许重复大量生产实验所需的转基因细胞，③MACS免疫磁珠分离技术较流式细胞术更适于纯化大量目的细胞。
本文采用以Thy1.1为表面标志、携带IL17或siRNAIL17基因的逆转录病毒载体转染BDC/NOD T淋巴细胞，携带IL17和siRNAIL17 基因的逆转录病毒在T淋巴细胞中具有高效转染率，为研究细胞因子在1型糖尿病发病中的作用建立了实验平台，是本实验的一大特色。
【参考文献】(siRNAIL17和IL17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL17的表达)
1 Wynn TA.T(H)17：a giant step from T(H)1 and T(H)2〔J〕.Nat Immunol，2005；6(11):106970.
2 Kolls JK，Lindén A.Interleukin17 family members and inflammation〔J〕. Immunity，2004;21(4):46776.
3 Wang B，Gonzalez A，Benoist C,et al .The role of CD8+ T cells in the initiation of insulindependent diabetes mellitus〔J〕.Eur J Immunol,1996;26(8):17629.
4 Mitchell TC,Hildeman D,Kedl RM,et al.Immunological adjuvants promote activated T cell survival via induction of Bcl3〔J〕.Nat Immunol，2001;2(5)：397402.
5 Phillips JM，Haskins K，Cooke A.MAdCAM1 is needed for diabetes development mediated by the T cell clone，BDC2.5〔J〕.Immunology，2005;116(4):52531.
6 Vukkadapu SS，Belli JM，Ishii K,et al.Dynamic interaction between T cellmediated betacell damage and betacell repair in the run up to autoimmune diabetes of the NOD mouse〔J〕.Physiol Genomics，2005;21(2):20111.
7 Hui EK，Yap EM，An DS,et al.Inhibition of influenza virus matrix (M1) protein expression and virus replication by U6 promoterdriven and lentivirus mediated delivery of siRNA〔J〕.J Gen Virol，2004;85(7):187784.
