1.3 实验动物和细胞 4～6 w龄的自身免疫性糖尿病BDC2.5/NOD小鼠和先天免疫缺陷NOD.scid小鼠购自美国Jackson实验室，饲养于美国辛辛那提医学研究基金会动物实验中心，源于293细胞系的PhoenixTM Eco逆转录病毒包装细胞、逆转录病毒载体MSCVIRESThy1.1、pLL3.7U6 Promoter和BANSHEEThy1.1逆转录病毒载体和作为阳性对照的Bcl2MIT质粒均为美国David A.Hildeman实验室赠予。大肠杆菌DH5α细胞株购自Invitrogen公司。
1.4 含IL17基因MIT的逆转录病毒载体的构建及鉴定 两端携带有SalⅠ和BglⅡ酶切位点的IL17 PCR产物与pGEM T载体连接，转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃过夜，小量提取重组T载体质粒，采用SalⅠ和BglⅡ双酶切鉴定重组T载体，酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用UVP图像分析仪成像。大量提取阳性重组T载体，并进行阳性重组T载体测序分析。阳性重组T载体和MIT载体在SalⅠ和BglⅡ限制性内切酶作用下共孵育，IL17与MIT载体连接，重组质粒再次转化DH5α感受态细胞，小量提取重组质粒，鉴定MITIL17，大量提取阳性的目的重组质粒备用。
1.5 携带Thy1.1U6siRNAIL17基因的逆转录病毒载体的构建及鉴定 利用siRNA引物合成的正向和反向的寡核苷酸链经过溶解、退火、稀释后，实验浓度的双链siRNA于-20℃保存备用。HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的U6增强子和pLL3.7逆转录病毒载体，在T4 DNA连接酶协助下双链siRNA毗邻U6增强子插入到pLL3.7载体中。小量提取并验证重组质粒pLL3.7U6siIL17，并测序；酶切重组质粒，T4连接酶连接U6siRNAIL17酶切片段和经过线性化与去磷酸化处理的pMNDBANSHEEThy 1.1逆转录病毒载体，并通过其两端的XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切位点以及Thy1.1中含有的一个XhoⅠ酶切位点，鉴别pMNDBANSHEEThy1.1质粒是否携带上U6siRNAIL17基因。阳性质粒筛选、扩增并大量提取后备用。
1.6 转基因T细胞的建立(siRNAIL17和IL17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL17的表达)
1.6.1 Phoenix包装细胞的转导、逆转录病毒的生产和筛选 Phoenix细胞系293T包装细胞。经铺板、孵育至对数生长期，在2.5 mol/L CaCl2和2×HEPES协助下，逆转录病毒载体滴加入Phoenix细胞培养液中，经5%CO2、37℃培养，换液，收获病毒。转导前后使用抗鼠Thy1.1PE抗体染色和流式细胞仪进行鉴定。
1.6.2 BDC T细胞的活化和活化度的鉴定 N2窒息处死4～6 w龄的BDC/NOD小鼠，解剖脾脏，研磨匀浆，用5%cDMEM培养液冲洗，台盼蓝染色，细胞计数。将2.5×107个脾细胞加入含有CD3(1.5 μg/ml)、CD28单抗(1.5 μg/ml)和IL2(50 U/ml)的5%cDMEM培养液中，5%CO2、37℃培养40 h；活化前、后分别使用CD4PE、Vβ4FITC，CD4PE、CD69FITC，CD4PE、CD62LFITC，Thy1.1PE、Thy1.2FITC染色，流式细胞仪鉴定细胞性质和T细胞的活化度。
1.6.3 病毒转染T细胞 病毒上清和活化的T细胞在聚凝胺作用下，37℃，760 g离心2 h，病毒转染T细胞，与IL2共同孵育24 h，收获转基因T细胞，Thy1.1PE/Thy1.2FITC单抗染色，流式细胞学测定细胞转染率。(siRNAIL17和IL17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL17的表达)
1.6.4 MACS筛选转染T细胞 ①收集转染的T细胞，MACS缓冲液清洗，离心，去上清，加入5 μg BiotinantiThy1.1/107细胞，4℃避光孵育20 min，洗涤，离心，去上清，加入antiBiotin磁珠稀释液，4℃避光孵育15 min，洗涤，离心，去上清，将上述准备的细胞加入磁性MS Column中，分离Thy1.1阴性和阳性的细胞；②收集Thy1.1(-)细胞，MACS缓冲液清洗，离心，去上清，细胞计数，加入10 μl/107细胞Thy1.2磁珠，4℃避光孵育10 min，洗涤，离心，去上清，将标记细胞加入磁性MS Column中，分离Thy1.1(-)/Thy1.2(-)和Thy1.1(-)/ Thy1.2(+)细胞，Thy1.1(-)/Thy1.2(+)细胞将作为对照组参与实验；③收集Thy1.1(+)细胞，经MACS缓冲液清洗，离心，去上清，加入20 μl Multisort消磁试剂/ml细胞悬液，轻轻混匀，4℃避光孵育10 min，洗涤，离心，去上清，重新悬浮细胞，再加入15 μl的Multisort终止液/ml，并立即加入2 μl的Thy1.2磁珠，4℃避光孵育10 min，洗涤，离心，去上清，并加入置于磁性分离器上的MS Column中，分离Thy1.1(+) /Thy1.2(-)和Thy1.1(+)/ Thy1.2(+)的细胞，收集后者用于后续实验。
1.6.5 转基因BDC T细胞的鉴定 分别收集Thy1.1(-)/Thy1.2(+)细胞和Thy1.1(+)/ Thy1.2(+)细胞，进行细胞计数。用CD4Biotin、BDC2.5 TCRBiotin和StreptavidinCyChrome标记细胞，流式细胞仪分析。按5×105/2 ml细胞培养液加入IL2(50 U/ml)，5% CO2、37℃ 24孔板中孵育24 h。收集上清液测定IL17含量,收集细胞进行抗体染色和流式细胞学鉴定。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
