2.7 QT-PCR实验 依次在100 μL EP管中加入10 μL SYBR Green Supermix溶液， 0.2 μL Primer 1 （10 μmol·L^-1） ，0.2 μL Primer 2 （10 μmol·L^-1），8.6 μL Sterile water，1 μL DNA template （1∶10 cDNA dilution），稍离心； PGC-1α程序设定温度为95 ℃ 5 min，98 ℃ 15 min，65 ℃ 20 min，68 ℃ 1 min；40个循环之后结束反应；PGC-1α的上游引物 （5′-3′）CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为（5′- 3′）GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为（5′-3′）TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游 （5′-3′）CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。
　　药物处理组和生理盐水组基因表达差异用下面公式计算（1）：2-ΔΔCt=2-（CtPGC-1αgene. drug-CtGAPDHgene. drug）-（CtPGC-1αgene. NS-CtGAPDHgene. NS），其中CtPGC-1αgene. drug为给药组PGC-1α基因的循环数，CtGAPDHgene. drug为给药组GAPDH内参基因的循环数，CtPGC-αgene. NS为给生理盐水组PGC-1α基因的循环数，CtGAPDHgene.NS为生理盐水组GAPDH内参基因的循环数。
　　2.8 数据分析 实验结果的数据以±s表示。应用Microsoft Excel软件中t检验方法进行统计学分析，P<0.05表示有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 药材提取物对KM小鼠肺部组织中PGC-1α mRNA的影响 初步考察了查干嘣嘎对KM小鼠肺组织中PGC-1α mRNA靶基因的调节作用。分别给予KM小鼠生理盐水，50 mg·kg^-1查干嘣嘎总提取物后，定量分析肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平。结果显示给予查干嘣嘎总提取物后，肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平升高，说明药材提取物对健康小鼠肺部组织中的PGC-1α mRNA表达具有上调作用；与生理盐水组（NS）相比，50 mg·kg^-1查干嘣嘎总提取物的上调作用达到了1.5倍左右。鉴于动物肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平差异较大，因此未对实验结果进行统计学分析。
　　3.2 药材提取物对C57BL/6J小鼠组织中PGC-1α mRNA的影响 进一步考察了查干嘣嘎提取物对不同品系小鼠肺组织中PGC-1α mRNA基因的调节作用。分别给予C57BL/6J小鼠生理盐水，50 mg·kg^-1查干嘣嘎总提取物后，定量分析肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平。结果显示给予查干嘣嘎总提取物后，肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平也升高，说明药材提取物对C57BL/6J小鼠肺部组织中的PGC-1α mRNA表达也具有上调作用；与生理盐水组（NS）相比，50 mg·kg^-1查干嘣嘎总提取物的上调作用达到了3倍左右。鉴于动物肺部组织中PGC-1α mRNA表达水平差异较大，未对实验结果进行统计学分析。

     3.3 A549非小细胞肺癌中PGC-1α mRNA的表达 非小细胞肺癌是肺癌中的一种，也是多种肿瘤中恶性程度较高的一种。在肿瘤中，恶性程度越高，PGC-1α mRNA表达水平越低，通过药物或外界物质的刺激能够诱导PGC-1α mRNA在肿瘤细胞中的表达，PGC-1α mRNA的表达量的增加能够诱导肿瘤细胞的凋亡。本实验考察药材提取物对A549非小细胞肺癌细胞株中PGC-1α mRNA的诱导作用，结果显示给予2，20 mg·L^-1查干嘣嘎总提取物4 h与8 h后，查干嘣嘎总提取物对PGC-1α mRNA的表达具有明显的上调作用，并呈现时间和浓度依赖性，见图1。经统计学分析：孵化8 h之后，与生理盐水组比较，20 mg·L^-1药物组PGC-1α mRNA的表达具有明显的上升且具有显著差异（P<0.01）；2 mg·L^-1的药物组PGC-1α mRNA的表达也有明显的上升且具有统计学意义（P<0.05）。但孵化4 h，给药组与生理盐水组相比较，PGC-1α mRNA的表达有明显的上升趋势，但没有统计学意义。
　　4 讨论
　　蒙医专家利用查干蹦嘎的相关复方治疗风湿性关节炎及关节疼痛，没有应用在肿瘤疾病的治疗方面。中药附子除了治疗风湿性关节炎及风湿性关节疼痛之外，还在治疗肿瘤疾病方面有应用，并且有大量相关抗肿瘤方面的研究资料。研究表明附子多糖能增强机体的细胞免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡和调节癌基因的表达，有显著的抑瘤作用^[5]，具有治疗恶性肿瘤的价值^[6]；附子提取物对鼠源路易斯肺癌细胞株LLC和其转移性LLC-R9的细胞株具有较强的抗增殖和诱导凋亡作用^[7]。蒙药查干蹦嘎（中药附子）是大热之品，有除湿散寒之功效；而PGC-1α在线粒体中与能量代谢相关，在恶性肿瘤组织中，PGC-1α的表达较正常组织有显著性的下降。通过药物调控肿瘤组织中PGC-1α的表达，将会诱导肿瘤细胞的凋亡。本实验结果也证实蒙药查干蹦嘎能够诱导A549肿瘤细胞细胞株中PGC-1α mRNA的表达，为裸鼠肿瘤模型抗肿瘤作用的进一步研究奠定了基础。
　　通过查干蹦嘎药材提取物对KM及C57BL/6J健康小鼠肺部组织中PGC-1α mRNA的上调控作用的研究，这种上调的原因可能与查干蹦嘎的性味归经大热有关。PGC-1α mRNA的表达与动物体中能量代谢代谢活跃的组织有关，PGC-1α是一种多功能的共激活体，参与线粒体的多种生物功能共激活调控核受体和转录因子的活性^[8-9]。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，如骨骼肌、褐色脂肪组织等^[10-11]，在褐色脂肪组织（BAT）和骨骼肌中调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成^[12]，在骨骼肌中调控有氧运动肌型转换及葡萄糖代谢^[13]，刺激肝糖异生^[14]，抑制β细胞的能量代谢和胰岛素的分泌^[15]。 最近研究发现PGC-1α的表达水平在乳腺癌^[16-17]和直肠癌^[18]组织中降低，说明其可能在癌症的病理过程中发挥作用。
　　查干蹦嘎药材提取物诱导A549肿瘤细胞细胞株中PGC-1α mRNA上调作用的研究，也是跟查干蹦嘎药材的药性有关，药材的大热之性直接影响了A549细胞中线粒体的能量代谢，从而影响了PGC-1α mRNA表达。PGC-1α表达的下调总是与过氧化物酶增殖体激活受体γ变化有关(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）