前言

我国是大豆生产大国，每年约有1／3的大豆 用于榨油，大豆榨油后的豆粕除了一部分用于发 酵工业如生产酱油外，一般作为饲料来处理．对豆 粕的微生物发酵处理，主要是提高豆粕蛋白的溶 解度，降低蛋白质的分子量，利于动物消化吸收， 同时降低其抗营养因子成分，增加饲喂价值，另外 发酵豆粕具有一定的芳香气味和鲜味，有一定的 诱食作用，适口性较好¨剖．
作者选用米曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌等生 产菌株为发酵菌种，探讨其不同搭配下在豆粕培 养基上固态发酵特征冲1，以期得到固态发酵豆粕 的适宜发酵条件及发酵过程中蛋白质的降解情 况，从一个侧面评价发酵豆粕的营养价值及潜在
应用前景．

1    材料与方法

1．1材料
1．1．1   菌种
米曲霉、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母均为河南工

收稿日期：2009_02-20
基金项目：河南工业大学引进人才专项基金项目(150193) 作者简介：惠明(1969一)，男，河南南阳人，副教授，工学博士，研究 方向为工业微生物与发酵工程．
业大学发酵工程实验室保藏．
1．1．2原料与试剂
黄豆芽、马铃薯购于农贸市场；豆粕、麸皮购 于郑州西郊启明饲料厂；其他化学试剂均为分析 纯；蛋白胨、酵母膏、琼脂等为生化试剂．
1．1．3主要仪器设备
净化工作台、全温振荡器、恒温培养箱、高压 灭菌锅、紫外一可见分光光度计、分析天平、离心 机、酸度计等．
1．1．4主要检测试剂及配制方法 茚三酮溶液(5．0 mg／mL)：依次称取0．5  g
茚三酮、O．3 g果糖、10．0 g磷酸氢二钠及6．0 g 磷酸二氢钠，用水溶解定容至100    mL，于冰箱中 保存．
氨基酸贮备溶液(O．2  mg／mL)：称取0．107 2 g甘氨酸，用水溶解定容至100 mL．此溶液每1 mL中含氨基态氮0．2   mg．
氨基酸标准使用液(2   pg／mL)：移取1．O mL 氨基酸贮备溶液于100   mL容量瓶中，用水定容至 刻度．此溶液每1 mL中含氨基态氮2“g．
十六烷基三甲基溴化铵(cTMAB)(15．O mg／mL)：称取1．5 g十六烷基三甲基溴化铵，用 水溶解后定容至100 mL．此溶液每1   mL中含氨
基态氮2仙g．
1．1．5   培养基
(1)分离纯化培养基‘71 察氏培养基(米曲霉分离平板)、马铃薯蔗糖
培养基(米曲霉斜面)、LB培养基(枯草芽孢杆菌
分离平板)、麦芽汁培养基(酵母菌分离平板)均 按文献[1]制备．
(2)液体种子培养基
米曲霉种子培养基：1    000 g黄豆芽加水
1  000 mL，煮沸30 min，过滤后滤液加麦芽糖30
g，溶解后补水至1   000 mL，用乳酸调pH值为
4．5，分装三角瓶后于12l℃灭菌20    min．
枯草芽孢杆菌种子培养基：胰蛋白胨1     g，酵 母提取物0．5 g，氯化钠l  g，葡萄糖1 g，100  mL 水，121℃灭菌20  min．
酵母菌种子培养基：干麦芽磨碎，与水按1：4 混和，在65℃水浴锅中糖化3～4     h，糖化程度可 用碘滴定．将糖化液用4～6层纱布过滤．滤液稀
释至5—6Bej调pH  6．4，121℃灭菌20 min． (3)基础发酵培养基 豆粕加10％麸皮，按料水比1：1加水，分装
三角瓶后包纱布塞，再用报纸包扎后于121℃灭
菌20 min．
1．2   方法
1．2．1   菌种分离复壮方法
出发菌株一制备菌悬液一分离培养基平板_÷ 涂布分离一纯化培养_试管斜面保存一性能测 定．培养方法均参考以上几种常用生产菌株的培 养条件．
1．2．2豆粕固态发酵工艺条件
豆粕加10％麸皮，按料水比1：1混匀，分装 三角瓶后包纱布塞，再用报纸包扎后，121℃灭菌
20 min，冷至室温后接种一定量菌种后摇匀，于40
℃发酵60  h即可得到发酵豆粕样品，注意发酵过 程中要及时振摇发酵培养基，使菌体和豆粕能够 均匀混合，充分接触，尽量避免因固态发酵致使菌 体和培养基接触不均匀，发酵不充分，给试验造成 较大误差．
1．2．3发酵前后样品的预处理和游离氨基酸的
提取 (1)发酵豆粕的预处理和提取方法 游离氨基酸浸提：在发酵样品中加10倍发酵
样品质量的蒸馏水，在80℃水浴中分3次浸泡提
取，每次大约40  min左右，然后将样品进行离心 分离，取上清液，废渣再加水继续浸泡提取离心分
离，提取3次，最后合并滤液，即可得到样品的游
离氨基酸提取液．
样品稀释：精确吸取上述样品提取液2    mL于
100 mL容量瓶中，定容至刻度，得样品稀释液，摇 匀待分析．
(2)未发酵豆粕的预处理和提取方法 称取和发酵试验等量的豆粕粉碎(过20目
筛)，加与样品中等量的蒸馏水，同样品处理方 法，进行浸泡提取豆粕中游离氨基酸，离心分离合 并滤液，稀释供分析．
1．2．4样品中游离氨基酸含量检测方法‘8。101 利用氨基酸的氨基与茚三酮水合物反应生成
蓝紫色络合物，该化合物在570   nm波长处有最大 吸收峰，且此吸收峰处吸光度大小与氨基酸释放 出氨基成正比．实验中，样品粉碎过20目筛，80
℃水，浸提30 min．
1．2．5甘氨酸标准曲线的绘制¨1
精确吸取1．00、2．00、3．00、4．00、5．00、6．00 mL甘氨酸标准品溶液分别置于6个100 mL容量 瓶中，并编号，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀．取6支 试管并编号，分别精确吸取上述溶液2．00 mL于 对应试管中，再分别加2．00 mL茚三酮显色剂．然 后放在水浴中加热煮沸20 min，显色产生络合物 后流水冷却至室温，分别加2．00   mL CTMAB，定 容至25．00 mL，以蒸馏水作空白对照，于570 nm 处测定吸光度，得到甘氨酸溶液标准曲线(y= O．089  8算+0．055 6，r=O．997 O)，甘氨酸浓度在
2．00～10．00斗g／L的范围内，与茚三酮络合物吸 光度呈良好线性关系．

2  结果与讨论

2．1   发酵豆粕试验参数的选择 根据预试验的结果，确定4个对蛋白质降解(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）