图2  分析型RP—HPLC分离RP55一E2一G5一R8 的洗脱曲线
2．2菜籽抗氯化肽的纯度鉴定和结构表征 利用串联质谱分析RP55一E2一G5一R8一F2。
一级质谱图如图3所示．由图3可以看出该组分仍 较复杂，主要组分的相对分子质量均在700以下， 选择tn／z值较大的2个母离子(更有可能是分子 离子)：662．36和684．34，进入二级质谱分析．
肽链在二级质谱分析中形成的碎片离子主
要有以下3种"]：(1)序列离子．如果肽离子的正 电荷保留在碎片离子的N末端，那么就得到a，b， c系列离子；如果肽离子的正电荷保留在碎片离 子的c末端，就得到x，y，z系列离子．(2)中间碎 片离子，包括中间酰基离子和亚氨离子．当两次解 离都在肽键部位，都产生b，y分割，那些至少由2 个氨基酸残基组成的碎片便称为中间酰基离子． 当两次解离时，一次产生b，y分割，另一次产生 a，x分割，形成的碎片即为亚氨离子．因此，亚氨 离子的出现便意味着肽序列中含有相应的氨基酸 残基．(3)卫星离子．当轰击能量较高时，氨基酸 侧链也会被打断，失去侧链的离子再经过肽键处 断裂，便形成卫星离子．此外，还可能会产生氨基 酸侧链脱氨离子(Gln，Lys，Arg)和脱水离子 (Ser，Thr，Asp，Glu)．总体来说，b系列和y系列 离子出现的机率较大，这是因为肽链中酰胺键更 容易断裂"1．
图4表明，在m／z<200的区域存在A蛐和 Arg的亚氨离子特征谱线，说明该肽中很可能含 有Asn和Arg；再根据图中给出的b系列离子m／z 值(bI：157．1．b2：271．2．b，：384．2．b4：481．3；b5：
662．4)两两之间的差值可以推知，在二级质谱中
从肽链c端被依次轰击下来的5个片段的m／z 值分别为181．1(b，-b．)，97．1(b．-b，)，113．0(b3- b：)，114．1(b：-b。)和157．1(b。)，其对应的氨基 酸残基分别为Tyr(Tyr，181．2)，Pm(Pro减去H 和OH，1 15．1．1．17)，Leu(Leu减去H和OH，
131．2．1—17)，A8n(Asn减去H和OH，132．1一l—
17)和Arg(Arg减去OH，174．1一17)．所以，m／z值 为662．36的肽离子的氨基酸序列应为Arg—Asn- Leu．Pro．Tyr，其理论相对分子质量和质谱测定值 吻合．由于质谱不能区分ku和ne，所以序列中 Leu也有可能为Ile．
图4  RP55一E2一G5一R8一F2一级质谱中母
离子(质荷比662．36)的二级质谱图
从图5可以看出，在m／z<200的区域存在
Leu和Tyr的亚氨离子特征谱线，即该肽中很可 能含有Leu和Tyr；根据图中给出的y系列离子 m／z值(yl：147．1；y2：311．1；y3：424．2；y4：521．3； y，：684．3)两两之间的差值可以推知，在二级质谱 中从肽链N端被依次轰击下来的5个片段的m／z 值分另0为163．0(y5一y。)，97．1(y。一y3)，113．1 (y3一y2)，164．0(y：一y，)和147．1(y。)，其对应的 氨基酸残基分别为Tyr，Pr0，Leu，Tyr和Glu．所 以，m／z值为684．34的肽离子的氨基酸序列应为 Tyr-Pr0-Leu(Ile)•Ty卜Glu，其理论相对分子质量和 质谱测定值吻合。
m，z
图5  RP55一E2一G5一R8一F2一级质谱中母
离子(质荷比684．34)的二级质谱图

已鉴定的2个抗氧化肽的结构中均至少含 有1个Tyr．Tyr侧链中的苯环具有平面共轭的结 构，呈现大订键特征，电荷流动性强，使其去掉质 子后形成的自由基中间体趋于稳定，酚羟基的脱 氢反应相对更易进行．Ddvalos等人一1从蛋清蛋白 中分离出若干个抗氧化肽，发现N端是Tyr的肽 抗氧化活性最高；通过测定合成短肽(减少Tyr数 目)的抗氧化活性发现，肽链中损失1个Tyr将导 致其活性显著下降．同时也有人提出C端是Tyr 或Trp的三肽具有较强的清除自由基能力¨0。．此
外，已鉴定的2个抗氧化肽的结构中均含有1个
Pr0，这同chen等人的实验结果相似⋯。，他们从 大豆蛋白水解物中分离纯化得到6个抗氧化肽单 体，这些肽由5一16个氨基酸残基组成，每个肽中 都至少含有1个Pr0．除了氨基酸组成，肽的抗氧 化性还很可能与其含有某种特定的序列(活性中 心)有关。Sait0等人¨副在大豆抗氧化肽(Leu—Leu． Pro—His—His)结构基础上，合成了40种结构与之 相关的短肽并考察其活性。指出Pro．His．His是肽 发挥抗氧化活性的活性中心．Suetsuna等人¨31则 发现短肽(Ty卜Phe—Ty卜Pro．Glu—Leu)的O，•清除
活性很大程度上依赖于其C端序列(Glu．Leu)．
因此，菜籽肽的抗氧化活性与其特定的序列结构 也可能存在某种相关．

3   结论

通过RP-HPLc进一步分离纯化菜籽肽，并由 电喷雾串联质谱鉴定获得2个菜籽抗氧化肽的一 级结构，分别为Arg—Asn—Leu(Ile)-Pro—Tyr(相对分 子质量661)和Tyr—Pm-Leu(Ile)一Tyr-Glu(相对分 子质量683)．

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