前言

测定多肽一级结构的传统方法主要有DNA 顺序分析和Edman降解．尽管这两种技术已近乎 完善，但仍有一定的缺陷，如DNA顺序分析解决 不了翻译后加工所导致的氨基酸残基修饰的问 题，而Edm趴降解对于N端封闭的肽无法测 序⋯．20世纪80年代末发展起来的两种软电离 技术：电喷雾(electm8pmy ionization，EsI)和基质 辅助激光解吸电离(matrix  as8ist laser desorption i— onization，MALDI)，使质谱技术在蛋白质结构分 析上的应用发生了革命性的飞跃¨1．电喷雾．四极 杆-飞行时间(ESI—quadmpole—time     of night，ESI—Q— TOF)串联质谱是在传统的电喷雾质谱基础上，采 用飞行时间质量分析器代替四极杆质量分析器， 大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量范围．这 种新型的串联质谱可直接用于测定肽链的氨基酸 序列．
作者的研究表明"’，通过离子交换和凝胶过 滤色谱分离菜籽粗肽，可得到蛋白质含量高并具 有良好抗氧化活性的肽组分．为获得更高抗氧化 活性的组分并鉴定其结构，有必要对该组分进一 步分离纯化．反相高效液相色谱(rever8e      phase high—peIfo肿ance liquid chromatography，RP-HPLC) 是根据被分离物分子极性不同进行分离的，具有 分离效果好、速度快、检测灵敏度高和回收率高的
特点，是目前分离纯化蛋白质和肽，特别是小分子
肽类最有效的方法之一H1．因为RP．HPLC样品处 理量较少，所以一般被用作分离纯化的最后一步 手段．
作者拟用RP．HPLC对菜籽肽进一步分离纯 化，并采用电喷雾串联质谱测定抗氧化活性肽的 一级结构，探讨肽的结构与抗氧化活性之间的内 在关系．

1    材料与方法

1．1   材料
菜籽肽：实验室自制"1；二苯代苦味肼基自 由基(DPPH•)、乙腈(色谱纯)：S唔ma公司；其他 试剂均为分析纯．
1．2   实验方法
1．2．1   DPPH•清除能力测定
DPPH•清除能力测定方法参照zhu等旧1，略 作改动．配制0．1锄mol／L DPPH•溶液(以95％ 乙醇作溶剂)．称取一定量的样品，用去离子水配 制成一定浓度．按表l将各试剂或样品依次加入 试管，混合均匀，室温下准确反应30     min后，在
517 nm下测定吸光值．
表l  实验试剂安排        mL

竺!昱蛩：竺!Z⋯一⋯～⋯⋯。+蝴。翮样品舯嗍叫。不含样品和品ij；Z’；⋯磊
芝耄竺2：曼要量：：：!：：二芝j耋竺耋为人'讲师’博士•主要从事         矗和DPPH．；^⋯。。一，⋯含样～品一。’某含DPPH
清除率(％)=[1一(As—AsB)／(Ac—AcB]×100
1．2．2半制备RP．HPLC分离菜籽肤
HPLC系统：美国wate船；色谱柱：Hedem ODs一2  C，。反相色谱柱(10×250 mm)，江苏汉邦 有限公司；检测波长：220     nm；柱温：30℃；流速：2 mL／min；进样浓度：10   mg／mL；进样体积：100“L； 梯度洗脱条件：0—5  min 100％一80％A；5—20
min 80％一60％A；20—25  min 60％一0％A；25
～27 min 0％A；27—29 min 0—100％A；29—40
min 100％A(A：5％乙腈，含O．05％TFA；B：
80％乙腈，含0．05％TFA)重复进样，手工收集各 洗脱峰后冷冻干燥．
1．2．3分析型RP．HPLC分离菜籽肽
HPLC系统：美国wa￡e糟；色谱柱：SunFireTM C18 ODS(4．6×150 mm)，美国Waters公司；检测 波长：220 nm；柱温：30℃；流速：l   mL／min；进样浓 度：1．5 mg／mL；进样体积：20斗L；梯度洗脱条件：0
—10 min 100％一80％A：10—20 min 80％一40％ A；20～23 min 40％一0％A；23—25 min 0％A；25
—27 min 0～100％A；27—32 min 100％A(A：5％
乙腈，含0．05％rI．FA；B：80％乙腈，含O．05％
TFA)．重复进样，手工收集各洗脱峰后冷冻干燥．
1．2．4   电喷雾-四极杆-飞行时间(ESl一Q-TOF)串 联质谱分析抗氧化活性肽
Q—Tof PremierTM串联质谱仪：美国waters
公司．
所有分析均在正离子模式下进行．雾化气为 氮气，碰撞气为氩气，质荷比(m／z)扫描范围为50 一l 000．适量样品用超纯水溶解后，用电喷雾针 取5—10斗L注入质谱仪．上样后，先用TOF       MS
扫描模式得到样品的分子离子。再切换到TOF     MS
MS扫描模式检测子离子，调节碰撞能量的大小， 以便得到较好的二级谱图．

2  结果与讨论

2．1   利用RP—HPLc进一步分离纯化菜籽肽 作者前期的研究结果表明p1，由凝胶过滤色
谱可分离获得一个具有较高抗氧化活性的菜籽肽
组分(RP55一E2-G5)．利用RP—HPLc进一步分离纯 化这一组分，收集其中12个主要组分峰(见图1)。 分别测定其清除DPPH•的能力，结果表明：组分8 (命名为RP55一E2-G5一R8)的抗氧化活性最高，其清
除DPPH•的肋，。为0．054 mg／mL；其次是组分4，
清除DPPH•的肋150为0．067 mg／mL．两者的抗氧
化活性均显著高于RP55-E2一G5(清除DPPH•的
肋50为0．083 mg／mL)．

2．50

2．00  
I．50  
爰1．00  
O．50  
O．00  
O  ．00
 时l司／mi“ 
图l  半制备RP—HPLC分离砒，55一E2一G5洗脱曲线 使用分析型RP．HPLC对RP55一E2一G5一
R8进行分析，发现其仍不是单一组分，分别重复 收集其中2个主要组分峰(见图2)，测定其清除 DPPH•的能力．经计算，峰l(命名为RP55一E2 一G5一R8一F1)比峰2(命名为RP55一E2一G5一 R8一F2)的抗氧化活性稍高，其清除DPPH•的 ED50分别为O．063  mg／mL和0．082 mg／mL，均高 于RP55一E2一G5一R8(0．054 mg／mL)，这说明 由RP55一E2一G5一R8进一步分离所得2个主 要组分的抗氧化活性均比RP55一E2一G5一R8 略有下降，其原因可能是菜籽肽组分间存在协同 抗氧化作用，分离得到的单个组分比混合组分的 抗氧化活性降低．(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）