1.2 仪器及试剂
　　阿霉素（Adriamycin，ADR，购于上海阿拉丁试剂有限公司，纯度>98%），盐酸益母草碱（Leonurine hydrochloride，LH，购于武汉福鑫化工有限公司，纯度>98%），斑马鱼胚胎培养液（参照Zebrafish book标准，0.137 mol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.25 mmol/L Na2HPO4，1.3 mmol/L K2HPO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，4.2 mmol/L NaHCO3），PBS缓冲液，体视显微镜（上海长方化学仪器有限公司，XTZ-D型）。其他试剂均为国产分析纯。
　　1.3 方法
　　1.3.1 试剂配制 阿霉素以及盐酸益母草碱用二甲基亚砜（DMSO）助溶，将其配成贮存液，避光置于-20℃冰箱，实验时再以胚胎培养液稀释到所需浓度（实验组药物浓度：盐酸益母草碱+阿霉素=0+30 mg/L，30 mg/L+30 mg/L，60 mg/L+30 mg/L，120 mg/L+30 mg/L）。另设空白组（含0.1%DMSO的胚胎培养用水，不加阿霉素）以及对照组（含0.1%DMSO的胚胎培养用水，30 mg/L阿霉素，不加盐酸益母草碱）。
　　1.3.2 胚胎处理方法 根据预实验设定阿霉素浓度为30 mg/L，96孔板的样孔中预先加入各实验组溶液。再挑选发育48 h胚胎为模型，随机放入样孔中，每个实验组20个胚胎。随后于光照培养箱中恒温（28.5℃）孵育，并分别于施药后12 h， 24 h，48 h观察并记录各实验组胚胎的心脏形态、循环系统血流、心率等指标。为尽量减少实验误差，以上实验重复3遍，所用胚胎为同一批受精胚胎。
　　1.4 统计学分析
　　本研究采用重复测量的方差分析，比较斑马鱼个体心率随时间的变化及各用药组间的变化，应用SPSS 13.0软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，多组数据比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　体视显微镜下观察，实验组和对照组的斑马鱼胚胎，处理12 h、24 h、48 h后，斑马鱼心率较空白组减慢（表1）。但对照组胚胎心脏区域出现心膜出血症状，心跳微弱，血液循环受阻，血细胞在心区堆积（图1，2，3），随着时间的延长药物的作用持续，到48 h后心脏形态线性化，心囊水肿，血液循环停止，心跳微弱以至停止。而实验组中胚胎心脏区域出血症状以及心率较对照组有明显改善，且这种改善与盐酸益母草碱浓度正相关。
　　以空白组为参照，采用重复测量的方差分析，个体随时间的变化F = 99.397，P < 0.001，认为时间因素对心率变化是存在影响的，差异有统计学意义；以对照组为参照，采用重复测量的方差分析，个体随时间的变化F = 176.795，P < .001 认为时间因素对心率变化是存在影响的，差异有统计学意义；时间因素和分组因素：F = 0.437，P = 0.727，认为时间因素和分组因素不存在交互作用，差异无统计学意义。
　　3 讨论
　　阿霉素属蒽醌类抗肿瘤抗生素，具有抗瘤谱广、抗瘤作用强等特点，在临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤，但由于其具有独特的心脏毒性，使用受到限制[4]。益母草碱是从中草药益母草中提取分离的主要有效成分，现代医学研究表明，益母草具有调经止血兴奋子宫、减轻心肌细胞缺血再灌注所造成的损伤、抗血小板聚集、降低血液黏度、同时可以活化T淋巴细胞以及增强B淋巴细胞而增强机体的免疫功能等诸多作用[5]。

      　斑马鱼是研究脊椎动物早期发育的最重要的模式动物之一，胚胎发育在体外完成，经PTU处理后透明可见其心脏结构仅为一房一室，在形态上与人类心脏有很大的不同，但斑马鱼心血管发育异常与人类左心室发育不全相似，因此利用斑马鱼研究药物对人类心脏毒性的机制是可行的[6，7]。斑马鱼早期胚胎透明，发育24 h时已出现心跳，发育48 h时已形成功能化的心脏，借助显微镜很方便观察药物对心脏的毒性作用[8]。更重要的是斑马鱼胚胎在心血管系统循环缺失的情况下，仍然能通过对氧的被动运输而生存和继续发育一段时间。而在一些利用其他模型生物的研究中，胚胎常因心血管系统发育严重异常或全身严重畸形而早期死亡，从而终止了对心血管发育的观察[9]。
　　本研究显示，阿霉素对斑马鱼胚胎发育具有明显的心脏毒性作用，且其毒性随着药物作用时间的延长而增加，益母草碱对阿霉素引起的斑马鱼胚胎心脏毒性具有保护作用，且当浓度在120 mg/L以下时，随着益母草碱浓度的升高起保护作用增强。但益母草碱对阿霉素引起的斑马鱼胚胎心脏毒性的保护作用的分子机制以及信号通路有待进一步的研究。
　　[参考文献]
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　　[2] 黄惠琳，刘华钢，蒙怡，等. 氯化两面针碱对斑马鱼胚胎心脏影响的初步研究[J]. 广西医学，2011，33（5）：546-548.
　　[3] Wasterfield M. The Zebrafish book：A guide for the laboratory use of Zebrafish （danio retio）[M]. 4th ed. Eugene：University of Oregon Press，1993：31-46.
　　[4] 孙江波，于彩娜，徐丹，等. 中药人参、附子及其小复方参附汤抑制阿霉素心脏毒性损伤大鼠细胞凋亡的研究[J]. 辽宁中医杂志，2012，39（4）：754-756.
　　[5] 阮金兰，杜俊蓉，曾庆忠，等. 益母草的化学、药理和临床研究进展[J].中草药，2003，34（11）：15-19.
　　[6] 龚春华，李爱国，赵庆顺，等. 视黄酸对乙醇致斑马鱼胚胎心脏发育畸形的影响[J]. 实用儿科临床杂志，2010，25（1）：53-56.
　　[7] Teresa J Bohlmeyer，Steve Helmke，Shuping Ge，et al. Hypoplastic left heart syndrome myocytes are differentiated but possess a unique phenotype[J]. Cardiovascular Pathology，2003，12（1）： 23-31.
　　[8] 王思锋，刘可春，王希敏，等. 雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究[J]. 中国药理学通报，2009，25（5）：634-636.
　　[9] 孙淑娜，桂永浩 蒋缪，等. 叶酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏发育影响的实验研究[J]. 中华儿科杂志，2010，48（12）：905-912.
 

 

 

 

 

 

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