卵母细胞排出第一极体(1  PB)完成第一次减数 分裂后休止于第二次减数分裂的中期(M      II)，等待 受精。1PB含有和初级卵母细胞对应的遗传物质， 并且不参与受精和胚胎发育过程。取卵4      h后，1PB 完全和卵胞浆膜分离，一般认为取卵后6      h行活检 术效果佳⋯。随着激光切割在辅助孵化、活检配子 及胚胎应用周期的增多，实践及多项研究证明它安 全有效，避免了机械法和化学法的不足。卵母细胞 分裂异常多发生于第一次减数分裂，lPB的活检分 析对提示卵母细胞的异常具有重要价值。本研究旨 在建立1 PB的活检方法，观察活检后的卵母细胞受 精、卵裂及囊胚形成情况，评估活检操作对胚胎后续 发育的影响。

1材料与方法

1．1    卵母细胞来源收集2006年9月一2007年

不孕原因包括输卵管因素、排卵障碍、男 方因素等。分两种来源：①行人绝经期促性腺激素 (HMG)、HMG+氯米芬(CC)或重组促性腺激素(Gn)促排卵后行卵泡穿刺后人工授精、多囊卵巢综 合征(PCOS)患者的废弃卵母细胞；②单精子胞质 内注射(ICSI)后胚胎移植患者，ICSI术当天未成熟 的卵母细胞行体外培养后第2天成熟者。上述患者 经过知情同意，愿意将穿刺取出或废弃的卵母细胞 用于实验研究。
1．2    试剂、耗材、主要仪器设备   人输卵管液 (HTFl023，1026，1029)，美国SAGE；透明质酸酶 (80 IU／L)，美国Signm；7％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)， 美国Irvine Scientific；细胞培养皿；操作皿；显微注射 针及活检针，美国Humagen；显微操作仪(IX-70)，日 本Olympus；体视显微镜(SMZ800)，El本Nikon；激 光打孔系统(ZILOS—tk)，美国Hamilton；C02培养 箱。
1．3卵母细胞采集  患者经过常规检查后确定促 排卵方案。于自然周期或人工周期第3～5天用 HMG、HMG+CC或Gn，150—300 IU／d肌肉注射，5 d后开始行经阴道超声监测卵泡的发育。据卵泡生 长情况调整激素用量，直至1个优势卵泡直径达到18 mm以上或2—3个卵泡直径达到16 mill以上， 肌注HCG 10 000 IU。36 h后阴道超声引导下穿刺 取卵，将卵泡用连接15   kPa负压的17G穿刺针抽 吸，同时将卵泡液送入实验室，在体视显微镜下观 察，将卵冠丘复合物挑选出来，HTFl023洗一遍，移 入HTFl020中。
1．4   ICSI取卵后6  h行ICSI术。术前将卵母细 胞置于80  IU／L的透明质酸酶的3037皿中孔中，用 拉细的巴斯德吸管吹吸，脱去大部分卵母细胞周围 的颗粒细胞。再将它们移入3037皿外圈HTFl023 液后用机械法去除外周颗粒细胞，将无颗粒细胞的 卵母细胞移入ICSI操作液滴中，持卵针通过负压吸 住卵母细胞，并使1PB位于12点位置，将含有精子 的注射针从3点的位置刺入卵胞质，回吸胞质，注入精子后撤出注射针。

1．5   1PB活检ICSI结束后，更换注射针为活检针(内径20  lrm)，卵母细胞和活检针准备就绪后，通 过激光打孔系统，600 Hz非接触激光汽化透明带形 成一条平行于IPB平面的孔道(约10 0,m)，随后活 检针通过孔道吸出1PB，具体过程如图1。

圈1人孵母细胞IPB的活检 A：人孵母细胞ICSI；B：透明带激光打孔；c—E：1PB的活检过程

1．6胚胎的序贯培养1PB活检结束，立即将卵母 细胞移人胚胎培养液(HTFl026)做的微滴盖油的培 养皿中，放入37cC，5％C02培养箱。ICSI后16～18 h(第1天)在倒置显微镜下观察卵细胞受精情 况；40—48 h(第3天)观察胚胎分裂情况。将质量 较好的胚胎(4—10细胞期)移入囊胚培养液 (HTFl029)行序贯培养旧j。第5—6天观察囊胚形 成情况。同时对照组也进行上述指标的观察。
1．7   1PB形态的分级按卵母细胞lPB的不同形 态分为三级旧J。I级：极体圆或椭圆形，光滑平整； Ⅱ级：极体完整，表面粗糙；m级：极体不完整，碎裂。 观察不同形态极体的卵母细胞的受精率及胚胎后期 发育率。
1．8统计学处理利用SPSS 11．5统计软件建立数据库并进行分析，数值以菇．4-s表示，组间比较用x2检验(检验水准Ot=0．05)。

2结果

2．1活检结果共活检成熟卵母细胞85枚，成功 活检卵母细胞81枚，成功率95．3％。
2．2活检组和未活检组受精率、卵裂率和囊胚形成 率比较活检组：两原核(2PN)形成率、卵裂率和囊 胚形成率分别为82．7％、86．7％、38．8％；未活检 组：2PN形成率、卵裂率和囊胚形成率分别为81．7％、87．5％、34．9％。行x2检验，两组在2PN 率、卵裂率和囊胚形成率之间差异均无统计学意义(尸>0．05)。

2．3活检组中不同形态IPB卵母细胞受精率及胚 胎发育结果成功活检的81枚卵中，I、Ⅱ、Ⅲ级极 体的卵母细胞分别为30、29、22枚。不同形态的 lPB活检后，2PN形成率和卵裂率在三组间差异无 统计学意义(P>0．05)，但囊胚形成率在Ⅲ级组较 I、Ⅱ组显著降低(P<0．05)。见表2。

表2不同形态IPB卵母细胞 活检后受精及胚胎发育情况(活检组)

C与a、b组比较：P<O．05

2．4未活检组中不同形态1PB卵母细胞受精率及 胚胎发育结果186枚卵母细胞中，I、Ⅱ、Ⅲ级极 体的卵母细胞分别为7l、59、56枚。2PN形成率和 卵裂率及囊胚形成率见表3。

囊3不同形态IPB卵母细胞的 受精率及胚胎发育情况(未活检组)

c与a,b组比较：P<O．Ol

2．5活检组与未活检组中含同一形态级别1PB的 卵母细胞所获囊胚的比较      比较不同形态1PB在 活检组和对照组囊胚形成情况，发现I级组囊胚形 成率在活检组和对照组为48．0％V8     44．8％，II级 组为41．6％V8  42．9％，11I级组16．7％v8 13．3％。 X2检验示囊胚形成率在对应组别差异无统计学意 义(P>0．05)。

3讨论

3．1人卵母细胞1PB活检方法的研究极体活检 透明带打孔主要包括包括机械法，化学法和激光法。

根据大样本的统计，认为激光法更加优越【4]。本验对85枚MⅡ期卵母细胞行ICSI术后采用激光打 孔法进行极体活检，成功活检8l枚，成功率95．3％，和多项报道相类似。实验中发现，活检的成
功与否和操作的熟练程度密切相关。将1PB按形 态分为三级，发现有I级和Ⅱ级1PB的活检较Ⅲ级lPB困难。分析原因，认为可能因其这两种形态的lPB与卵母细胞更容易形成了较黏滞的细胞质桥， 极体和初级卵母细胞粘着，导致吸取的过程中吸力 的控制难以掌握。这种形态的卵母细胞在活检过程 中需注意掌控好活检针的吸力。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）