题目：外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响
p21waf1为野生型p53激活片段（wild-type p53 activated fragment 1，WAF1），它为单拷贝基因，是一种非常重要的抑癌基因，也是目前研究热点[1]。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）家族成员，是细胞周期蛋白（cyclin）与细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）的广泛抑制剂，主要参与细胞周期调控[2]。已有研究证实，p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用[3-5]。因此，本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中，使其稳定表达后，来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823（由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠），基因转染试剂盒（QIAGEN公司），Trizol试剂、DMEM-高糖培养基（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Takara公司），p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物及各自Taqman探针（由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供），鼠抗人p21waf1单克隆抗体（Santa Cruz公司），兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（QIAGEN公司）。
1.2 细胞培养方法 人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10％胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液，37 ℃、5％CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态，取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 基因转染条件和方法 参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞，分三个组，分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。
1.4 p21waf1 mRNA表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计：上游：5’-GGACAGCAGAGCACC
1.5 p21waf1蛋白表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，进行一抗（鼠抗人p21单克隆抗体）、二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗）孵育和显色，曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。
1.6 细胞增殖能力的检测 各组均取对数生长期的细胞，采用经典的MTT法检测后，绘制细胞生长曲线，分析各组细胞的增殖能力。
1.7 细胞周期分布的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，各约1×106个细胞，加入终浓度70％冷乙醇，4 ℃固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase酶（2 mg/ml）于37 ℃水浴30 min，再加碘化丙啶（25 mg/ml）染色，4 ℃避光20 min，经尼龙网滤过后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t 检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响 MTT证明，p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组，p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢，而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势，差异有统计学意义（P<0.01）。而空载体组及未转染组两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。各组p21waf1蛋白表达见图3。
3 讨论
据众多研究表明，细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一[6]。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统，其中Cyclin对CDKs有正性调控作用，CKI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用，对特定底物磷酸化，从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能[7]。p21waf1作为一种重要的CKI，可与多种cyclins-CDKs复合物结合（如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2、CyclinD-CDK4等）并抑制CDKs对特定底物的磷酸化作用。另一方面，p21waf1的C端还是DNA复制必需因子-增殖细胞核抗原（PCNA）结合域，其与PCNA结合后，阻碍其与DNA聚合酶结合成全酶复合物，从而在DNA复制过程中，阻止了全酶复合物在DNA单链上的滑动，使DNA得复制不能继续进行[8]。p21通过结合并起到对CDKs和PCNA的双重抑制，最终均导致细胞在增殖过程中，停滞在细胞周期G1/S关键点，并诱导细胞凋亡，进而抑制了细胞的继续无限增殖周期[8]。 [3] 张学彦，景德怀，刘志强，等.p21waf1基因对人食管鳞癌细胞增殖的抑制作用[J].世界华人消化杂志，2009，17（14）：1384-1389.
[4] 刘卫梅.p21在食管癌组织中的表达及临床意义[J].肿瘤基础与临床，2007，20（2）：173-174.
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[7] Chen J，Jackson P K，Kirschner M W，et al.Separate domains of p21 involved in the inhibition of Cdk kinase and PCNA[J].Nature，1995，374（1）：386-388.
[8] Yang K，Zheng X Y，Qin J，et a1.Up-regulation of p21WAF1/Ciplby saRNA induces G1-phase arrest and apoptosis in T24 human bladder cancer cells[J].Cancer Lett，2008，265（1）：206-214.
